为了证明SIM Basic在跟踪快速生物事件中的最佳性能，我们对永久表达GFP-α微管蛋白的HeLa细胞进行了实时成像，并用螺旋色素SiR溶酶体探针对溶酶体进行了染色。

在图1中，我们比较了宽场（WF），共聚焦（CF）和SR图像，显示出与传统显微镜相比，分辨率显着提高。此外，在图2中，去卷积转盘和SR数据之间的平行比较可以了解溶酶体囊泡的某些细节在SR图像中相对于去卷积的CF图像是如何可检测的，更清晰，并且肯定更清晰。

由于可以将SpinDisk Advance旋转盘与SIM Basic SR模块一起使用，因此可以在大视场（FOV）上进行快速实时成像（图3A），从大量细胞中获取重要数据，然后专注于单个细胞以跟踪亚细胞水平的溶酶体动力学（图3B）。

SIM Basic高速采集模式允许以高分辨率捕获相关数据，从而最大限度地减少光照和由此产生的光毒性风险。如图4所示，这种功能使我们能够探索精细标本的动力学并随着时间的推移追踪溶酶体囊泡。特别是，进行了连续30秒的SIM Basic SR延时摄影（图4A），监控快速事件，而不必担心漂白。图像质量和溶酶体运动随着时间的推移得以保留，这使得从溶酶体的跟踪中提取重要数据成为可能，例如囊泡的行进距离（um）和速度（um/s）（图4B）。

这些数据表明，SIM Basic将高速成像与光效率和灵敏度相结合。随着时间的推移，可以在亚细胞水平上监测快速生物事件，而不会出现漂白问题，从而有机会在活体标本上以高分辨率捕获相关数据。

图 2：显示溶酶体囊泡细节的去卷积 CF 和 SR 数据之间的平行比较;CF图像的反卷积由NIS Elements软件提供的3D Richardson-Lucy算法执行。这些图像是使用SIMTRUM SpinDisk Advance CF旋转盘系统与SIM Basic SR附加组件一起采集的，并配备了CFI Plan Apo Lambda 60X油物镜。

利用 SIMTRUM SpinDisk Advance 旋转盘和 SIM Basic SR 模块，我们有机会执行 CF 采集，以大致了解样品（图 5A）。一旦确定了感兴趣的区域，由于在不同成像模式之间快速轻松地切换，就可以发现分裂细胞并通过SR成像跟踪其整个有丝分裂过程。事实上，图33B报告了5分钟的实时SR延时，显示了具有非常清晰的细节的不同有丝分裂阶段。

传统结构照明显微镜（SIM）的主要缺点之一是光子剂量及其与微妙生物事件的兼容性;长时间暴露在光线下会损害正在进行的生物现象，这可能是一个问题，特别是如果我们考虑SIM图像重建所需的多个图像。

在这方面，为了证明SIM Basic不牺牲样品活力和生理的能力，我们监测了细胞超过12小时，如图6所示，细胞的健康根本没有受到损害，细胞分裂和没有细胞死亡证明了这一点。值得注意的是，图像质量会随着时间的推移而保持，允许进行更长的延时实验，而不会出现光毒性和光漂白问题。

总之，这些数据表明，SIM Basic SR模块具有大于10fps的时间分辨率和低光子负荷，能够毫不费力地研究活细胞动力学，并使用常规样品制备方案提供结构化定位成像。长期和快速生物事件都可以随着时间的推移进行监测，而不必担心漂白，从而有机会在亚细胞水平上追踪生物动力学，并使用SIM在活体样品上捕获有意义的数据。

一 乙

图 5：用螺旋色素 SPY 505-DNA（绿色）和 SPY 555-微管蛋白（红色）探针染色的 HeLa 细胞的实时成像。（一）大型视场的CF收购;（B） 单细胞焦点显示 33 分钟的实时 SR 延时。这些图像是使用SIMTRUM SpinDisk Advance CF旋转磁盘系统与SIM Basic SR附加组件相结合，并配备CFI Plan Apo Lambda 60X油物镜采集的。

使用用于活体生物成像（螺旋色素）的螺旋色素（https://spirochrome.com/）荧光探针进行细胞染色。特别是，我们用SPY 505-DNA，SPY 555-微管蛋白和SiR溶酶体探针标记细胞。

溶酶体追踪的动画记录了30秒，没有延迟;记录用于细胞分裂成像的电影33分钟（3分钟延迟）（图5B）和12小时15分钟（15分钟延迟）（图6A）。

本应用纪要中显示的HeLa细胞由Lia Asteriti博士和Giulia Guarguaglini博士提供，他们来自罗马国立大学分子生物学和病理学研究所。