宽场（WF）和共聚焦（CF）显微镜可能足以研究细胞和组织的形态和动力学，但通常不足以准确回答所有生物学问题。事实上，在WF和CF显微镜中，亚细胞结构仍然无法进入并被衍射极限所隐藏。 获得更高水平的信息可以带来新的发现，在这方面，超分辨率（SR）显微镜已成为生命科学领域越来越受欢迎和强大的工具，用于研究精细细胞结构和亚细胞成分及其动态过程。这些类型的实验通常需要克服衍射极限，使WF显微镜可以实现的横向和轴向分辨率加倍。 在过去几年中，技术和应用并行发展，导致有关SR技术或显示SR在生命科学应用中的已发表论文呈指数级增长。然而，尽管这些技术具有巨大的潜力，但SR仍然存在重大限制，主要与其成本和复杂性有关。由于一些负面含义，包括特殊的样品制备，深度渗透差和成本过高，SR在日常实验室生活中还不是常规的。 出于这些原因，在SIMTRUM，我们正在努力使所有研究人员都能使用SR，并提升其科学发现的潜力，将其提升到一个新的水平。 我们的最新产品SIM Basic就是为此目的而开发的，它是第一个基于结构照明的SR模块，与任何现有的带有相机端口的正置或倒置显微镜兼容，它与CF显微镜一样易于使用，它使科学家能够访问有关其生物样品的深层数据。 特别是，基于多点结构照明系统，SIM Basic能够研究高达~100 nm的XY分辨率的细胞结构，并且可以使用高（300X-60X）和低（100X-20X）放大倍率物镜获得Z分辨率高达~40 nm的超分辨率光学切片。 SIM Basic设计用于处理厚度与CF显微镜中使用的样品相当的样品，在本应用说明中，我们将重点介绍不同神经生物学样品在高放大倍率下的超分辨率深度成像。
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| 在低放大倍率下对透明样品进行超分辨率成像 |
| 为了证明SIM Basic在低放大倍率物镜下的最佳性能，我们使用CFI Plan Apo Lambda 20X空气物镜（NA 0.75，WD 1）比较了复杂和厚透明生物样品中的宽场（WF）、共聚焦（CF）和SR图像。 在图1中，显示了清除的小鼠肠切片（0.55毫米厚）的不同可视化，其中血管为绿色，细胞核为红色。特别是，由于三种显微镜方法之间的快速切换，我们报告了 WF、CF 转盘和 SR 采集量为 125 um（图 1A）的全球比较，以及 SIM Basic SR 采集的 3D 视频，显示了肠绒毛的精细细节（图 1B）。 在图2中，显示了具有表达GFP的神经元的清除小鼠脑切片（0.55mm厚）。值得注意的是，我们获得了一个复杂的神经元网络的150 um Z堆栈，显示为最大强度投影（MIP）（图2A）和3D体积视图（图2B）。 从这些图像中可以很好地理解，从WF，CF和SR模式切换可以达到更高的分辨率增益，即使在高厚度下也能增强神经元网络的精细细节。 此外，我们决定将20X SR采集与60X CF采集进行比较，如图2C和2D所示，与20X CF采集相比，使用SIM Basic采集不仅具有明显的分辨率改进，而且能够达到与配备CFI Plan Apo Lambda 60X油物镜（NA 1.4， WD 0.13）。与20X CF相比，除了神经元细节质量的显着提高（图2D）之外，使用带有20X物镜的SIM Basic还可以比普通60X油物镜（130 um）的最大工作距离更深入地进入样品（图2C）。
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图 1：（A） WF、CF 旋转磁盘和 SIM 基本 SR 3D 卷视图的比较。（B）SIM Basic SR采集的3D视频，厚度为130 um。（C）使用SIMTRUM SpinDisk Advance CF旋转盘和SIM Basic SR系统获取的树突棘的可视化和强度剖面比较。 |
这些图像表明，得益于Z分辨率高达~300 nm的超分辨率光学切片，SIM Basic可以为大型CF采集添加更深层次的细节。事实上，SIM Basic 设计用于处理厚度与 CF 显微镜相当的样品，提供超过 50 μm Z 深度的超分辨率数据。这意味着唯一的限制是物镜的工作距离，并且可以从原生异构复杂样品中获得更有意义的数据。 |
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| 常规制备样品的超分辨率成像 |
| 在未清除的样品中，主要生物成分（如蛋白质、脂质和水）的不同折射率在穿过组织时会导致更大的光散射。因此，光线不容易深入样品，从而导致深度SR成像出现问题。 借助SIM Basic，我们也能够在常规制备的厚样品中提供SR，而无需特殊的样品制备，并且我们可以超分辨3D样品，其尺寸与CF显微镜常规成像的大小相当。 为此，我们测试了几种散射神经生物学样品，并在图2中显示了具有表达GFP的神经元的常规制备的小鼠脑样品（100 um厚度）的不同可视化。特别是，我们专注于树突棘，正如图2A和2B中很好地报告的那样，与WF和CF转盘数据相比，这些详细的突起在超分辨率图像中更容易检测到和清晰。此外，该样品的超分辨率3D渲染（图2C）表明，即使在样品内部60 um深处也可以欣赏这种纳米尺寸的突起。 |
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| 图 2：具有表达 GFP 的神经元的常规制备小鼠脑样品的 WF、CF 转盘和 SIM 基本 SR 采集的比较。（A） Z 堆栈的最大强度投影，（B） 神经元结构细节和 （C） 3D 体积视图，60 um 厚度。这些图像是用SIMTRUM SpinDisk Advance CF旋转磁盘系统以及SIM Basic SR附加组件采集的。
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| 图3表示表达GFP的小胶质细胞的小鼠大脑（250um厚度）的不同可视化，尽管存在不可避免地在未清除组织中产生光散射的生物结构，但可以在与CF显微镜通常达到的深度相当的深度进行采集，从而显着提高分辨率和图像质量（图3A）。这在图3B和3C中得到了很好的显示，我们专注于特定的小胶质细胞。观察了形态特征，并且由于在WF，CF转盘和SR之间轻松快速地切换，因此可以增强难以理解的精细细胞结构，因此将SIM Basic作为细胞形态学研究的有力工具。 SIM Basic 的使用不仅限于固定标本，而且由于 > 10fps 的时间分辨率（在 1024x1024 像素的视野中），并最大限度地减少了光照，从而降低了光毒性的风险，SIM Basic 高速采集允许将 SR 显微镜也应用于体内研究。
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| 图 3：用表达 GFP 的小胶质细胞对常规制备的小鼠脑样品进行 WF、CF 转盘和 SIM 基本 SR 采集的比较。（A） 3D 体积视图，72 um 厚度，（B） 最大强度投影和 （C） 显示单个小胶质细胞细节的正交视图。这些图像是使用 SIMTRUM SpinDisk Advance CF 旋转磁盘系统以及附加的 SIM Basic SR 获取的。 |
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| 在图4中，我们报告了表达遗传编码荧光Ca 2 +指示剂（绿色）和泛神经元标记物（红色）的活转基因秀丽隐杆线虫的CF转盘和SR采集的比较。将转基因线虫限制在微流体装置中，并用乙酰胆碱受体特异性激动剂1mM左旋咪唑麻痹。 这种简单的固定，加上SIM Basic高速时间分辨率，足以使超分辨率显微镜也能对活体样品进行。特别是，我们报告了3D体积重建（图4A），然后专注于头部感觉神经元和中间神经元（图4B），在CF采集方面获得了显着的分辨率和图像质量。 总之，这些数据表明，SIM Basic能够处理厚度与CF显微镜中通常使用的样品相当的样品，从而提供超过50 um Z深度的超分辨率数据。这意味着可以使用常规制备方案从天然异质复杂样品中获得更有意义的数据。
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图 4：表达基因编码荧光 Ca2+ 指示剂（绿色）和泛神经元标记物（红色）的活转基因秀丽隐杆线虫的 CF 和 SIM 基本 SR 采集。（A） 3D 体积可视化，33.5 um 厚度，以及 （B） 来自 Z 堆栈的最大强度投影，显示头部神经元细节。这些图像是使用 SIMTRUM SpinDisk Advance CF 旋转磁盘系统以及附加的 SIM Basic SR 获取的。 |
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| 从单通道到高分辨率的快速多通道成像 |
多通道成像通常用于研究组织内不同细胞类型之间的相互作用。为此，我们设计了SIM Basic，以处理从400到750 nm的全光谱，以便在荧光团选择方面提供最大的灵活性和最佳的多通道成像，而不会有光谱重叠。 在图5中，显示了具有树突棘（黄色），小胶质细胞（洋红色），星形胶质细胞（白色）和DNA（青色）的神经元的小鼠脑组织切片，总体积为30um。这些图像表明，使用SIM Basic，不仅可以轻松地从WF切换到CF和SR显微镜技术，而且SR也可以对常规染色样品进行快速而深入的多色成像。此外，利用我们的CF转盘系统的规格，我们还可以做更多的事情，并使用双摄像头功能同时采集多个通道，从而加快采集速度。 总之，所有这些数据加在一起证明了系统的可塑性。将 SIM Basic 与 CF 显微镜相结合，可以灵活地选择感兴趣的区域，并轻松切换到 SR，以显示亚细胞细节中的所需部分，只需单击一下即可将分辨率提高一倍。 我们认为，所有科学家都应该可以使用SR来推进他们的研究。生物学发生在3D中，探索SR中的所有三个维度以扩大发现潜力至关重要。
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图 5：常规制备的小鼠脑组织切片的 WF、CF 转盘和 SIM 基本 SR 采集，显示具有树突棘（黄色）、小胶质细胞（品红色）、星形胶质细胞（白色）和 DNA（青色）的神经元。（A） 来自 Z 堆栈的最大强度投影和 （B） SIM Basic SR 采集的 3D 视频，厚度为 30 um。这些图像是使用 SIMTRUM SpinDisk Advance CF 旋转磁盘系统以及附加的 SIM Basic SR 获取的。
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| 显微镜方法 |
本应用笔记的所有采集均通过尼康Eclipse Ti2显微镜进行，该显微镜配备了SIMTRUM SpinDisk Advance转盘系统，并配有SIM Basic超分辨率附加组件，LDI激光照明器（89 North）和6.5 um像素（光度学）的Prime BSI Scientific CMOS（sCMOS）相机。我们使用CFI Plan Apo Lambda 60倍油物镜（NA 1.4，WD 0.13），并以0.3 um Z步长执行Z堆栈采集。 图2所示的小鼠大脑样本由罗马EMBL的Alvaro Crevenna博士和Emerald Perlas博士提供。 图3所示的小鼠大脑样本由罗马大学神经科学系Davide Ragozzino教授和Laura Ferrucci博士提供。 图4所示的秀丽隐杆线虫由Viola Folli和Enrico Lanza博士提供 生命纳米与神经科学中心（CLN2S@Sapienza Università di Roma-Istituto Italiano di Tecnologia）。 图5中表示的小鼠大脑部分由Silvia Di Angelantonio教授和Federica Cordella博士提供 生命纳米与神经科学中心（CLN2S@Sapienza Università di Roma-Istituto Italiano di Tecnologia）。 |