摘要

与传统显微镜相比，共聚焦显微镜通过消除离焦光、提供光学切片、降低背景噪声和采用优化的光学设计，提供了更高的分辨率。在本文中，我们首先讲述什么是离焦荧光，以及如何减轻离焦荧光。然后介绍了两个重要的概念，解释了为什么分辨率和对比度会影响图像质量。第三，我们介绍了共聚焦显微镜如何阻挡离焦荧光，以及共聚焦显微镜如何提高图像分辨率和对比度。最后，如何使用共聚焦显微镜通过单点扫描、线扫描和旋转圆盘创建二维图像。

离焦荧光

       显微镜中的离焦荧光问题通常称为背景荧光或离焦光。当样品发出的荧光与成像系统中的其他元素（例如周围介质、显微镜的光学器件或检测器）相互作用时，就会发生这种情况，从而导致背景信号模糊或模糊。

有几个因素会导致出现离焦荧光：

光散射：当激发光穿过样品时，它会散射出样品周围的介质或其他结构。散射光会影响背景信号，尤其是当它被检测器收集时。

折射率不匹配：在某些样品中，样品与周围介质或封固剂之间可能存在折射率不匹配。这种不匹配会导致光线弯曲或散射，从而导致它们偏离所需的成像路径并导致散焦信号。

光学像差：显微镜的光学元件（例如透镜或反射镜）的缺陷会导致光学像差。这些像差会导致荧光信号模糊和扩散到焦平面之外，从而导致荧光失焦。

检测器灵敏度：荧光显微镜中使用的检测器对光具有一定程度的敏感性，包括从离焦区域发出的荧光。即使样品被适当地照明和聚焦，检测器仍可能拾取一些背景荧光，从而导致图像对比度降低。

自发荧光：一些样品表现出固有的自发荧光，其中某些分子或结构在受光激发时自然发出荧光。自体荧光会影响整体背景信号，因此很难将其与感兴趣的特定荧光区分开来。

离焦荧光

如何减轻离焦荧光？

为了减轻离焦荧光的问题，可以采用以下几种技术：

正确的样品制备：使用合适的封固剂、透明剂或折射率匹配溶液有助于最大程度地减少折射率不匹配并减少样品内的光散射。

光学切片技术：采用提供光学切片功能的成像技术，例如共聚焦显微镜或双光子显微镜，可以选择性地从焦平面捕获荧光，同时拒绝散焦光。这些技术有助于提高图像对比度和分辨率。

反卷积算法：采集后图像处理技术，例如反卷积算法，可用于消除离焦荧光的影响。反卷积算法估计并校正由光学像差引起的模糊效果，从而产生更清晰、更聚焦的图像。

光谱分离：利用具有不同发射光谱的荧光探针并采用光谱成像或光谱分离技术可以将特定荧光信号与背景或自发荧光成分分离。

成像参数的优化：调整成像参数，如光照强度、曝光时间和检测器设置，有助于优化信号背景比，并最大限度地减少离焦荧光的影响。

通过采用这些策略，研究人员可以减轻离焦荧光的影响并提高荧光显微镜图像的质量。

显微镜的分辨率和对比度

分辨率和对比度是显微镜中的两个基本参数，它们决定了所获得图像的质量和可解释性。

分辨率：分辨率是指显微镜将两个间隔很近的物体区分为独立实体的能力。它决定了图像的细节水平和清晰度。换句话说，它量化了显微镜可以分辨的样品中两点之间的最小距离。

显微镜的分辨率受多种因素的影响，包括物镜的数值孔径 (NA)、用于成像的光的波长以及光学元件的质量。由 Ernst Abbe 制定的阿贝衍射极限提供了对传统光学显微镜可实现的最大分辨率的理论描述。根据这个限制，分辨率大约是光波长除以 NA 的一半。

已经开发了不同的显微镜技术来克服衍射极限并实现更高的分辨率。示例包括共聚焦显微镜、结构化照明显微镜 (SIM) 、受激发射耗尽 (STED) 显微镜以及随机光学重建显微镜 (STORM) 和光激活定位显微镜 (PALM) 等超分辨率技术。这些方法采用各种原理来提高分辨率并揭示样品中更精细的细节。

对比度：对比度是指图像中不同特征或对象的可区分性或视觉分离。它决定了区分感兴趣区域和背景或样本内不同成分的能力。

显微镜的对比度会受到诸如样品的固有特性、所采用的染色或标记技术以及成像参数等因素的影响。不同的显微镜技术可能具有固有的对比度机制，而其他显微镜技术可能需要额外的样品制备步骤来增强对比度。增强显微镜对比度的一些常用方法包括：

相差显微镜：一种利用透明标本引起的相移在所得图像中产生对比度的技术。

微分干涉对比 (DIC) 显微镜：也称为 Nomarski 干涉对比或 DIC 显微镜，该技术使用偏振光和光学棱镜，通过利用样品中折射率和厚度的差异来产生对比度。

暗场显微镜：在这种技术中，标本被倾斜或掠入射光照射，只有散射光被物镜收集。这会创建一个带有来自样品的明亮散射光的深色背景，从而增强对比度。

荧光显微镜：荧光标记或标记可用于选择性地标记样品中的特定成分，允许这些成分在背景下的高对比度成像。

染色：应用特定染料或荧光团选择性地标记或突出样品中感兴趣的特定结构或成分。

差异染色：使用优先结合样品不同成分的不同染料或染色剂，从而导致差异染色和对比度增强。

通过优化成像参数、采用适当的对比度增强技术以及为特定应用选择最合适的显微镜方法，研究人员可以提高分辨率和对比度，从而获得更清晰、信息量更大的显微镜图像。

共焦的工作原理

共聚焦显微镜的原理基于光学切片的概念，可以获取生物标本的高分辨率三维图像。与同时对整个标本进行照明和检测的传统广角显微镜不同，共聚焦显微镜一次有选择地照明和检测单个焦平面。

共聚焦显微镜的原理

共聚焦显微镜的关键部件和原理如下：

点照明：在共聚焦显微镜中，聚焦激光束用于照亮标本内的一个小点。该激光束通常通过物镜聚焦，并调整其直径以获得最佳分辨率。

针孔孔径：通过标本后，发射的荧光或反射光被同一物镜收集。然而，在到达检测器之前，收集到的光会通过一个针孔。针孔阻挡了从标本的离焦区域发射或反射的光，只允许来自焦平面的光通过。

扫描机制：为了生成图像，照明点以光栅模式扫描样本。这种扫描可以使用各种方法来实现，例如检流计反射镜、声光偏转器或转盘与螺旋图案。通过逐点扫描激光束，生成焦平面的完整二维图像。

共焦检测：穿过针孔的光被引导至检测器，例如光电倍增管 (PMT) ，检测器将光信号转换为电信号。然后使用检测器的输出来构建图像。

共聚焦显微镜的好处如下：

光学切片：通过选择性地照亮单个焦平面并阻挡散焦光，共聚焦显微镜提供了出色的光学切片功能。这使得能够获取厚样本内薄切片或焦平面的清晰且定义明确的图像。

提高分辨率：与宽视场显微镜相比，消除散焦光和抑制散射光可提高轴向和横向分辨率。针孔孔径将光检测限制在一个受限区域，从而获得更好的图像对比度和分辨率。

3D 成像：通过顺序扫描标本内不同深度的多个焦平面，共聚焦显微镜可以重建三维图像堆栈。可以对这些堆栈进行可视化和分析，以观察标本内结构或过程的空间分布。

降低背景噪音：共聚焦显微镜能够抑制散焦光并最大限度地减少背景噪音，从而提高图像清晰度和对比度。这在对具有高水平自发荧光的样品进行成像或将特定荧光信号与背景荧光区分开来时特别有用。

共聚焦显微镜在各个领域都有应用，包括细胞生物学、神经生物学、发育生物学和生物医学研究。其光学切片功能和改进的分辨率使其成为可视化和研究样本内复杂生物结构和过程的宝贵工具。

免责声明： 图片来源于网络，如有侵权请联系删帖。